مقدمه :

تشخیص صحیح و به موقع یک عفونت ویروسی از نظرآینده نگری، همه گیرشناسی و درمان مهم است حتی اگر روش مناسبی برای درمان آن بیماری وجود نداشته باشد. روش های سنتی برای تشخیص آزمایشگاهی عفونت های ویروسی شامل جداسازی ویروس و اندازه گیری آنتی بادی های موجود رسوم افراد تحت آزمایش بوده است اما امروزه روش هایی مانند جفت نمودن اسید نوکلئیک و استفاده از واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR)در تشخیص عفونت های ویروسی به کار می رود.

روش های تشخیص عفونت های ویروسی :

از دو راه می توان اقدام به تشخیص بیماری ها و یا عفونت های ویروسی کرد :
1 – تشخیص وجود ویروس و یا آنتی ژن های ویروسی
2 – تشخیص آنتی بادی های ضد ویروس ها

1- تشخیص وجود ویروس و یا آنتی ژن های ویروسی :

می توان با دیدن مستقیم با استفاده از میکروسکوپ الکترونی برای نشان دادن ویروس های عفونت روده ای در انسان و حیوان و ویروس هایی که در پوست و مخاط ایجاد جراحت می کنند استفاده کرد. در روش ایمون الکترون می توان به نمونه انتی سرم اختصاصی حاوی آنتی بادی اضافه کرد تا ویروس ها در میکروسکوپ الکترونی قابل تشخیص تر باشند و حساسیت این روش افزایش یابد برای نشان دادن آنتی ژن ویروسی در یک نمونه باید بین نمونه تهیه شده و آنتی بادی های آن واکنش ایجاد کرد که برای این کار روش های گوناگونی وجود دارد .

الف) روش الیزا :

به آن ارزیابی ایمنی با آنزیم (EIA) نیز گفته می شود که روشی بسیار حساس بوده و برای نشان دادن آنتی بادی های ضد ویروسی نیز به کار می رود. دارای روش های گوناگون است که اساس همه آنها اتصال به یک سطح سفت است. برای افزایش حساسیت این روش می توان از قدرت اتصال بالای آویدین برای بیوتین سود جست.

ب) سنجش ایمنی با استفاده از مواد رادیو اکتیو (RIA) :

به روش مستقیم و یا روش غیرمستقیم انجام می گیرد که در روش مستقیم نمونه را به آنتی بادی اختصاصی متصل شده به پلیت اضافه نموده و پس از شستشو، آنتی بادی اختصاصی نشان دار شده با ماده رادیو اکتیو را به مجموعه آنتی ژن – آنتی بادی اضافه نموده و پس از انکوباسیون و شستشو در دستگاه مخصوص نتایج را می خوانند و در روش غیر مستقیم آنتی بادی اختصاصی را به پلیت متصل نموده و نمونه را به آن اضافه کرده و آنتی بادی اختصاصی را می افزاییم که در نهایت به مجموع فوق آنتی بادی نشاندار اختصاصی ضد آنتی بادی را اضافه و نتیجه را در دستگاه می خوانیم .

ج) ایمونو فلورسنس : این روش به علت حساسیت، سرعت، سادگی نسبی اهمیت خاصی به خصوص در مورد بیماری هاری دارد. دو روش رنگ آمیزی وجود دارد :
1 - مستقیم که در آن آنتی بادی ضد ویروس را با رنگ فلورسنت نشاندار کرده و پس از شستشو نتیجه را در میکروسکوپ دارای اشعه ماوراء بنفش مشاهده می کنند.
2 – غیرمستقیم (ساندویچ) که در آن ایمونوگلوبولین ضد آنتی بادی اختصاصی را با رنگ فلورسنت نشاندار می کنند.
ضد آنتی بادی اختصاصی به کار رفته TgG است.

د) رنگ آمیزی با پراکسید آز : این روش مشابه ایمونوفلورسنس است اما به میکروسکوپ مخصوص نیاز ندارد که در آن آنتی بادی نشان دار شده با آنزیم را به آنتی ژن تحت آزمایش اضافه کرده سپس سوبسترای مناسب آنزیم را به مجموعه فوق اضافه می کنیم وقتی آنزیم پراکسید از مصرف می شود، سوبسترا عبارت است از H2o2 که با یک مشتق بنزیدین مخلوط شده تا در حضور این آنزیم تشکیل یک رسوب رنگی را بدهد.

2 – تشخیص آنتی بادی های ضد ویروس : با بررسی وجود IgM در خون انسان ها و بادام ها می توان به وجود بیماری پی برد، با توجه به این که آنتی بادی در اوایل عفونت اولیه ایجاد شده بنابراین وجود آن دلیل بر عفونت تازه است. چون IgM نمی تواند از جفت انسان عبور کند وجود آن در خون نوزاد دلیل بر آلودگی داخل رحمی است.

برای بررسی وجود آنتی بادی های سرم و اندازه گیری آنها روش های گوناگونی وجود دارد :
الف) روش الیزا

ب) روش RiA

ج) خنثی کردن ویروس به توسط سرم : در این روش ابتدا سرم حاوی آنتی بادی های خنثی کننده ویروس را به مدت نیم ساعت درحمام ماری°56(سانتی گراد) حرارت داده سپس مقادیر مساوی از ویروس و سرم را مخلوط کرده و بعد از انکوباسیون به یاخته های حساس اضافه و درانکوباتور قرار می دهند. اگر در سرم آنتی بادی های اختصاصی ویروس وجود داشته باشد عفونت زایی ویروس خنثی شده و CPE ایجاد نمی شود.

د) پیشگیری از هماگلوتیناسیون : اگر آنتی بادی اختصاصی و ویروس را مخلوط کرده و سپس به گلبول های قرمز اضافه کنیم هماگلوتیناسیون انجام نخواهد شد.
ذ) ایمونوفلورسنس

هماگلوتیناسیون :
ویروس های تعدادی از خانواده های ویروسی انسان یا حیوانی می توانند با گلبول های قرمز پیوند تشکیل دهند.
ر) وسترن بلاتینگ : در این روش ویروس را تخریب نموده، پروتئین های آن را با استفاده از الکتروفورزدرژل پلی آکویل آمید جدا ساخته، بر روی پرده نیترو سلولوز انتقال داده ، آنتی سرم را به آن اضافه می کنیم، آنتی بادی ضد IgG که نشان دار است را به آن افزوده و نتیجه را با الیزا می خوانیم.

نشان دادن اسید نوکلئیک ویروسی : به غیر از روش های معمول که برای جدا کردن ویروس ها و یا نشان دادن آنتی ژن آنها به کار می رود راههای سریع دیگری برای تشخیص بیماری با نشان دادن اسید نوکلئیک ویروسی وجود دارد که در این کار از اسید نوکلئیک نشاندار شده به عنوان الگو استفاده کرده و اسید نوکلئیک ویروسی را با آن جفت می کنند. اساس جفت نمود این است که DNA یک رشته ای، با پیوند هیدروژنی بین بازهای جفت با رشته مکمل DNA یا RNA جفت می شود برای این کار DNA را حرارت داده تا دو رشته آن جدا شوند پس از سرد شدن RNA و یا DNA، الگو را به آن اضافه می کنند تاعمل جفت شدن انجام شود.

برای جفت نمودن اسید نوکلئیک راه های گوناگونی وجود دارد:
الف) جفت نمودن بر روی اسید نوکلئیک ثابت شده (DBH) :
با جوشاندن اسید نوکلئیک استخراج شده از ویروس و یا از یاخته آلوده دو رشته آن را هم جدا نموده وآن را به صورت لکه ای بر روی پرده فیلتر نایلون باردار شده و یا نیترو سلولز قرار داده تا به آن متصل نمود. سپس DNA یا RNA یک رشته ای الگو را که با ماده رادیو اکتیو نشان دار شده به اسید نوکلئیک تحت آزمایش اضافه کرده و آن را شستشو می دهند تا الگوهای متصل نشده زایل شوند. علائم ایجاد شده توسط الگوی متصل شده را با اتو رادیوگرافی اندازه می گیرند.

ب) جفت نمودن با روش ساترن بلات:

DNA را با استفاده از اندونوکلئازهای محدود به الیگونوکلئوئیدهای کوتاه تر تقسیم کرده و با استفاده از الکتروفورز بر روی ژل آگازر یا ژل آکریل آمید آنها را از هم جدا می کنند و با مواد قلیایی دناتوره می کنند سپس DNA های جدا شده را بر روی پرده های فیلتر نایلون و یا نیتروسلولز انتقال داده و با پراب های نشاندار شده جفت کرده و مورد بررسی قرار می دهند.

ج) واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) :

در باید دو الیگونوکلئوتید کوتاه را به زنجیرهای DNA موجود در دو طرف منطقه مورد نظر، هر کدام برای یکی از دو رشته DNA جفت نمود. تکثیر به روش PCR از آنزیم DNA پلی مراز شماره یک که از باکتری ترموس – آکواتیکوس گرفته شد و در برابر حرارت مقاوم است استفاده می شود.

(TAP) روش PCR سه مرحله دارد :
1. ذوب کردن دو رشته DNA ویروس تحت آزمایش
2. متصل کردن الیگونوکلئوتیدهای پریر که بتوانند با نوکلئوتیدهای موجود در زنجیرهای مجاور محلی که باید تکثیر شود پیوند تشکیل دهند.
3 . تکثیر DNA که با امتداد دادن پریمرها توسط آنزیم TAP پلی مراز انجام می شود.
با توجه به مقاومت Tap در برابر حرارت دوره ذوب کردن و جفت نمودن را می توان 30-25 بار تکرار کرده و صدها میلیون کپی از قطعات DNA تکثیر شده تولید کرد.

جداسازی ویروس :

این روش به عنوان یک روش استاندارد و تنها روشی که می تواند یک ویروس کاملاً جدید را کشف کند جایگاه خود را حفظ کرده است.

تهیه نمونه برای جداسازی ویروس :

نمونه ها که از بیمار تهیه می شود لازم است در زمان مناسب و سریع به آزمایشگاه انتقال یافته و کارآماده سازی و تلقیح آن به میزبان مناسب (کش سلول ، تخم مرغ جنین دار، حیوان آزمایشگاهی) نیز به سرعت انجام پذیرد. نمونه مدفوع را باید در روی دستگاه مخلوط کننده یکنواخت کرد. نمونه های بافت را با قیچی ابتدا خرد کرده و با دستگاه مخصوص شیرابه یکنواختی از آن تهیه کرد. قبل از تلقیح لازم است نمونه را فیلتر کرد تا باکتری ها و قارچ های آلوده کننده حذف شوند.

تکثیر ویروس در کشت یاخته :

انتخاب نوع یاخته به نوع ویروس تحت مطالعه بستگی دارد. اگر نمونه به درستی تهیه شده باشد و یاخته های حساس نیز به کار گرفته شوند می توان انتظار اشت که ویروس هایی که احتمالاً در نمونه وجود دارند در یاخته تکثیر پیدا کنند.

تشخیص تکثیر ویروس :

یاخته های شاهد باید مورد بررسی قرار گیرند چون اگر کشت یاخته ها را بیش از یک هفته نگهداریم ممکن است در یاخته های آلوده نیز تغییراتی شبیه CPE ایجاد شوند. با دیدن CPE ، بررسی اطلاعات مربوط به علائم بیماری و نوع نمونه ارسال شده به آزمایشگاه می توان اقدام به تشخیص مقدماتی ویروس کرد اما اگر CPE مشاهده نشود و یا در مورد آن شک وجود داشته باشد باید پاساژ دوم و یا سوم (پاساژکور) نیز انجام شود.

تکثیر ویروس در حیوانات آزمایشگاهی :

از گونه های حیوانی به ویژه آنها که فاقد آنتی بادی اختصاصی هستند می توان برای جداکردن ویروس هایی که قابل کشت نیستند استفاده کرد مثلاً تزریق داخل آمنیون جنین مرغ حساس ترین روش برای جدا کردن ویروس های آنفلوآنزا و تعدادی از ویروس های طیور است.

تعیین هویت یک ویروس :

هویت یک ویروس را می توان یا به طور قطعی و یا به طور موقت شناسایی کرد. در شناسایی موقت بر پایه نشانه های بالینی بیماری، بافتی که ویروس از آن جدا شده و نتایج ظاهری حاصل از تکثیر ویروس در کشت یاخته (CPE)، هماد سورپشن، میکروسکوپ الکترونی ویروس را شناسایی کرد و برای تعیین هویت قطعی ویروس لازم است که با استفاده از آنتی سرم های اختصاصی اقدام به تشخیص آنتی ژن های ویروس نمود که آزمایش های به کار گرفته شده برای این منظور آزمایش هایی مانند روش الیزا، بررسی ایمنی با استفاده از مواد رادیو اکتیو (RiA)، وسترن بلات، خنثی کردن ویروس، جلوگیری از هماگلوتینا سیون ، ایمونوفلورسانس، ایمونو دیفوزین (که همگی در صفحات قبلی توضیح داده شده اند) هستند.

  سؤالات گفتار سیزدهم

1 – چند روش قدیمی برای مشخص کردن آنتی ژن های ویروسی را نام ببرید؟

 ثبوت عناصر مکمل – سوب درژل و خنثی کنندگی

2- روش الیزا به چه شکلی انجام می گیرد؟

 ابتدا آنتی بادی را به یک سطح سفت که از گوده های موجود در پلیت های میکروتیتر که از پولی استیرین و یا پولی وینیل ساخته شده متصل می کنند و نمونه تحت آزمایش را به آنتی بادی اضافه کرده و پس از انکوباسیون اقدام به شستشوی آن می کنند.سپس آنتی بادی اختصاصی را که با آنزیم نشاندار شده به مجموعه آنتی بادی – آنتی ژن اضافه کرده و پس از انکرباسیون و شستشو، سوبسترای مخصوص آنزیم را به مجموعه فوق اضافه می کنند. اگر آنتی ژن و یا ویروس تحت آزمایش به آنتی بادی اول متصل شده باشد در آن صورت آنتی بادی نشان دار هم به آنتی ژن های ویروسی خواهد چسبید و در نتیجه سوبسترا تحت تأثیر آنزیم تغییر رنگ خواهد کرد که با چشم قابل رویت و با دستگاه اسپکتروفتومتر قابل اندازه گیری است.

3 – افزودن بیوتین و آویدین به موادی که در روش الیزا به کار می روند چه فایده ای دارد؟

 به علت قدرت اتصال بالای بیوتین و آویدین، آنتی بادی را با بیوتین نشاندار نموده و آویدین را به آنزیم متصل و آن را به آنتی بادی اختصاصی اضافه می کنند تا با این عمل حساسیت روش الیزا افزایش یابد.

4 – در روش خنثی کردن ویروس جهت تشخیص قطعی نوعی ویروس چرا باید سرم حاوی آنتی بادی های خنثی کننده را حرارت داد ؟

 جهت غیرفعال کردن کمپلمان و عوامل غیراختصاصی که ممکن است از فعالیت ویروس مورد نظر جلوگیری کنند.